PCR法とは

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PCR法の原理

PCRとはポリメラーゼ連鎖反応( polymerase chain reaction)と言い、世界初且現在ではもっとも使われてる遺伝子増幅法であり、医学・薬学・生物学などの研究現場や臨床検査で幅広く使われています。1983年にキャリー・マリス(Kary Mullis)によって発明され、ノーベル賞を受賞した。

遺伝子増幅の発見

人の細胞の中には核酸をコピーする為のたんぱく質があり、DNAをコピーするものはDNAポリメラーゼ、RNAをコピーするものはRNAポリメラーゼと言います。

ポリメラーゼの働きを簡単に言うと、細胞液のなかからDNAの原料となる塩基を集めて来て、参照してるDNAの並び通りに並んで、その結果DNAのコピーが出来ます。

「遺伝子とは」ってい記事の中には、たんぱく質の働き、DNAの塩基構造などについて語っています、ここでは割愛します、良かったらご覧ください。

元々DNAポリメラーゼは細胞の中で生物電子信号の指示の元に働いてますが、それが試験管内で特殊な環境(温度をある規律で変換する)を与えることで、試験管内でもDNAをコピーできると発見された事が、PCR法の始まりである。

それを応用し、参照してるDNAを雛形(PCR検査の場合は検体の中にあるDNA配列)に対し:

  • 実際DNAをコピーするDNAポリメラーゼ
  • どこからどこまでをコピーするか、範囲を指定する目印(プライマー、後ほど説明する)
  • コピーを作成するときの原料となる塩基
  • DNAポリメラーゼを働かせる為の温度コントロール装置(PCR機械)

これらを付き加えれば、PCR法の完成である。

PCR法の試薬構成

酵素:DNAポリメラーゼ

酵素は複雑なたんぱく質であり、生体で起こる化学反応に対して触媒として機能する分子である。
触媒という意味は、そのたんぱく質自身の複雑な三次元構造の可動性を駆使して、化学反応自体を操作されてるからです。


DNAポリメラーゼは酵素の一種であり、DNAの複製を触媒し、即ちDNA複製の実質な作業者です。
DNAポリメラーゼは色んな種類があり、色んなメーカのPCR試薬では異なるDNAポリメラーゼを使う場合があります。

プライマー

プライマーは、PCRが増やしたい標的遺伝子配列の範囲を決めるものです。
遺伝子増幅において、遺伝子配列のどこの部分を増やしたらいいのか、その情報をDNAポリメラーゼに伝える必要があります。

そこで使われるのは、増やしたい部分の始まりと終わりの部分を示す短いDNA断片(またはRNA断片)である。

プライマーという断片があれば、そこから起点として、DNAポリメラーゼが塩基から配列を組み立てて、DNAのコピーが出来ます。

dNTP

dNTPはDNAやRNAの原料である。
作業者(DNAポリメラーゼ)と指示(プライマー)があっても、原料がなければDNAのコピーが作られません。

dNTPはdATP、dCTP、dGTP、dTTPのヌクレオチド4つのMIXで出来ているので、イメージとしては、DNAポリメラーゼがdNTPから必要な原料を持っていて、プライマーの位置からDNAのコピーを組み立てるという感じです。

マグネシウムイオン(Mg2+

マグネシウムイオン(Mg2+)はdNTPの取り込みを可能にすることで、DNAポリメラーゼ活性の補因子として機能します。
PCR反応が結果的にどの位をコピーできるのかは、マグネシウム濃度のコントロールに関わってきます。

参考資料

PCRのセットアップで考慮すべき6つの要素(Thermo Fisher)

PCR法の遺伝子増幅原理

前文の試薬構成を踏まえて説明します。

  • 雛形DNA:コピーされる側のDNAです。検査では、雛形DNAがない場合は陰性となります。
  • 酵素:DNAコピーを実行する酵素です。dNTPを持ってきて、雛形DNAと対照的な配列(A⇒T、C⇒G)を組み立てていきます。DNAは二本鎖なので、両方に対照的は配列が生成すれば、元と全く同じDNA配列がコピーされます。
  • プライマー:コピーされるDNAの範囲を指定します。プライマーは短い塩基断片で、そこを起点としてコピーが作成されます。PCR法ではプライマーが二つあるので、両側から真ん中へ作られる形になります。
  • dNTP:DNAのコピーとなる原料です。
PCR法でDNAをコピー(イメージ)
PCR法でDNAをコピー(プロセス)

RT-PCRとは

増幅対象がDNAではなくRNAである場合があります。
例えば新型コロナウイルスのPCR検査はウイルスのRNAの検出を目的にしています。

DNAポリメラーゼはRNAを増幅させるわけにはいかないので、そのためにはRNAをDNAに変換するという前処理必要があり、そこで開発されたのが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(reverse-transcriptase PCR)である。

通称RT-PCR

PCR法が遺伝子検査での応用

感染症遺伝子検査

  • HBV・HCV・HIV(定量)
  • HPV・HSV・クラミジア・淋菌(定性)
  • 結核・非結核性抗酸菌・新型コロナウイルス・B群レンサ球菌(GBS)(定性)

がん遺伝子検査

  • FLT3遺伝子変異(急性骨髄性白血病)
  • Major BCR-ABL融合遺伝子変異(慢性骨髄性白血病)
  • BRAF遺伝子(悪性黒色腫・肺がん・大腸がん)
  • HER2遺伝子(乳がん・胃がん)
  • BRCA1/2遺伝子(卵巣がん)
  • ALK融合遺伝子変・EGFR遺伝子変異・ROS1融合遺伝子変異(肺がん)
  • K-ras遺伝子変異・RAS遺伝子変異(大腸がん)
  • c-kit遺伝子変異(消化管間葉系腫瘍)

遺伝学的検査

  • 産婦人科関連:習慣流産、不妊症、高齢妊娠、無侵襲的出生前遺伝学的検査 (NIPT) 
  • 神経筋疾患関連:筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳変性症、パーキンソン病、ミトコンドリア病、先天性ミオパチー、シャルコー・マリー・トゥース病、筋強直性ジストロフィー
  • 内分泌代謝疾患関連:褐色細胞腫、家族性高コレステロール血症、多発性内分泌腫瘍症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ミトコンドリア病、先天性副腎過形成、ヘモクロマトーシス、糖尿病、原発性アルドステロン症
  • 循環器疾患関連:肥大型・拡張型心筋症、先天性QT延長症候群 、ブルガダ症候群、家族性大動脈瘤・解離、左室緻密化障害 
  • 遺伝性腫瘍関連:家族性大腸腺腫症、遺伝性乳がん・卵巣がん、リンチ症候群、リ・フラウメニ症候群、ポイツ・イェガース症候群
  • その他:マルファン症候群、エーラス・ダンロス症候群、オスラー病、骨形成不全症、多発性嚢胞腎、難聴、レックリングハウゼン病、遺伝性血栓症
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